changliulab

by Yechun Hong 20201122

构建并提取AD（pGAD-T7）和BD（pGBK-T7）相关质粒（保证浓度及纯度）；
配制YPDA、SD/-L-W、SD/-L-W-H-A等相关固体和液体培养基；
制备酵母感受态细胞：
1. 将酵母菌株（AH109）在YPDA固体培养基平板上划线，30℃培养箱倒置培养3天左右，至单克隆长至直径2-3 mm大小；
2. 挑取一个酵母单克隆至装有5 mL YPDA液体培养基的50 mL离心管中，在30℃培养箱中以200 rpm振荡培养16-20 h；
3. 将5 mL上述菌液接入装有100 mL YPDA液体培养基的250 mL三角瓶中，在30℃培养箱中以200 rpm继续振荡培养4-5 h，至OD₆₀₀为0.6-0.8；
4. 将菌液分装至两个50 mL离心管中，室温以4,000 rpm离心5 min收集菌体；
5. 倒去上清，用45 mL无菌去离子水重悬酵母菌体，室温以4,000 rpm离心5 min收集菌体；
6. 重复操作（e）一次；
7. 室温以4,000 rpm离心5 min收集菌体后倒去上清，并加入3 mL 1.1× TE/LiAc溶液重悬酵母；
8. 将重悬菌液分装至1.5 mL离心管中，室温4,000 rpm离心1 min收集菌体；
9. 倒去上清，每个离心管加入600-800 μL 1.1× TE/LiAc溶液重悬菌体，待用。
根据实验设计在同一个1.5 mL离心管中加入：

1 μg AD**质粒

2 μg BD**质粒（根据质粒浓度和感受态浓度调整）

10 μL salmon sperm DNA**（鲑鱼精DNA，已98℃加热15 min使其变性）
每个1.5 mL离心管中加入100 μL步骤3中所制备的新鲜酵母感受态细胞；
加入600 μL PEG/LiAc溶液，迅速振荡使其充分混匀；
在30℃培养箱中放置培养30 min；
加入70 μL DMSO，上下颠倒使其混匀，42℃水浴热激15-20 min；
冰上放置2-3 min，室温4000 rpm离心1 min收集菌体；
倒去上清，加入700 μL 1.0× TE重悬菌体，室温4,000 rpm离心1 min收集菌体；
倒去上清，加入500 μL 1.0× TE重悬菌体，室温4,000 rpm离心1 min收集菌体；
吸取并弃去约400 μL上清，重悬菌体并将均匀涂布在SD/-L-W固体培养基上，30℃培养箱倒置培养3天左右至单克隆长出；
挑取合适大小的单克隆，用600 μL SD/-L-W液体培养基在30℃培养箱中振荡培养过夜，
室温4,000 rpm离心1 min收集菌体并用1 mL无菌去离子水重悬菌体，按10×、100×、1000×的比例稀释菌液，并将菌液点在SD/-L-W-H-A平板培养基上。30℃培养箱倒置培养3-4 天，观察并拍照记录结果。

酵母转化相关试剂及培养基配置：

1）YPDA 培养基配制：

YPDA 培养基（1 L）
Yeast extract	10 g
Peptone	20 g
D-Glucose	20 g

加入800 mL去离子水使固体试剂充分溶解后，用1 M KOH调整至pH6.5，（若为配置固体培养基，则加入20 g Agar/ 1L YPDA）,121℃高压灭菌15 min后使用。

2）SD/-L-W和SD/-L-W-H-A培养基配制：

SD/-L-W或SD/-L-W-H-A培养基（1 L）
Minimal SD base（Clontech）	26.7 g
SD/-L-W（或SD/-L-W-H-A）	0.64 g（或0.60 g）
D-Glucose	20 g

加入800 mL去离子水使固体试剂充分溶解后，用1 M KOH调整至pH6.5，（若为配置固体培养基，则加入20 g Agar/ 1L SD）,121℃高压灭菌15 min后使用。

3）1.1× TE/LiAc溶液配制（现配现用）：

1.1× TE/LiAc溶液（10 mL）
10× TE溶液	1.1 mL
1 M LiAc溶液	1.1 mL

用无菌去离子水定容至10 mL并充分混匀。

4）PEG/LiAc溶液配制（现配现用）：

PEG /LiAc溶液（10 mL）
10× TE溶液	1 mL
1 M LiAc溶液	1 mL
50% PEG3350溶液	补至10 mL

* 10× TE溶液（100 mL）：Tris 1.211 g、EDTA 0.37 g、浓盐酸调整至pH7.5，121℃高压灭菌20 min后待用；

* 1 M LiAc溶液（100 mL）：10.202 g LiAc，醋酸调整至pH7.5，121℃高压灭菌20 min后待用；