大量提取RNA
- 将准备好的材料(2g左右)放入预冷的研钵(用前需要灭菌)中,进行快速充分的研磨。将研磨好的样品转入高速离心管中,加入10-20ml trizol。将高速离心管置于冰上放置。
Note:研磨过程中必须保证样品一直在低温状态,研磨样品直到植物组织呈现细粉状可停止磨样,一般每个样品耗时12-15分钟左右。
- 待所有样品研磨完毕,取出冰上的高速离心管,剧烈涡旋震荡30s-1min。将高速离心管置于roller wheel 上室温涡旋1hr-1.5hr。使trizol和样品充分反应。
- 取下离心管,加入五分之一体积的氯仿。剧烈涡旋震荡。室温静置到自然分层。
- 12000rpm 4℃离心15min后吸取上清,转移到新的灭过菌的高速离心管中。再次加入等体积的氯仿,剧烈涡旋震荡,室温静置到自然分层。
- 12000rpm 4℃离心15min后吸取上清,转移到新的灭过菌的高速离心管中。加入等体积的异丙醇,剧烈涡旋震荡,室温静置30min-1hr。
- 12000rpm 4℃离心20min,可以看到管底有白色沉淀。轻轻倒出离心管中液体。保证沉淀不随倾倒流出。
- 加入75%乙醇15-20ml,轻轻震荡,使沉淀悬浮,静置2-3min。
- 12000rpm 4℃离心30min,轻轻倒出离心管中液体,此步需要格外小心,不要使沉淀流出。
- 再次将高速离心管离心 4℃ 12000rpm 3-5min, 用灭过菌的枪头吸取管底残留乙醇。将离心管倒置于无菌的滤纸上3min左右,加入65℃的DEPC水1-2ml,回溶RNA。
Note:不要干燥过久,会使RNA分子间脱水而造成RNA不溶解。如RNA干燥过度,可将加入DEPC水的高速离心管放于65℃烘箱中半个小时,充分溶解RNA。
- 待RNA 充分溶解后,将RNA转移到1.5ml或者2ml ep管中,进行进一步的纯化。
- 以纯化600微升的RNA样品为例,吸取600微升RNA 到全新的EP管中,加入等体积的125:24:1酚(PH<5.0):氯仿:异戊醇,4℃ 12000rpm高速离心,15min。
- 吸取500微升的上清液到新的ep管中,再次加入等体积的125:24:1酚(PH<5.0):氯仿:异戊醇,4℃ 12000rpm高速离心,15min。
- 吸取400微升的上清液到新的ep管中,加入等体积的氯仿再次抽提,以去除残留的酚。4℃ 12000rpm高速离心,15min。
- 吸取300微升的上清液,加入30微升的3M醋酸钠(PH=5.2 DEPC 水配置并灭菌)600微升的无水乙醇。震荡混匀,置于-20℃冰箱,过夜沉降。
- 次日4℃ 12000rpm高速离心 30min。小心弃掉上清液,加入1ml的75%乙醇,震荡,使RNA沉淀悬浮起,室温放置3-5min。
- 4℃ 12000rpm高速离心 30min。小心弃掉上清液。
- 再次4℃ 12000rpm高速离心 2min。10微升枪头吸取残留酒精。
- 室温干燥RNA 3min左右,加入200微升65℃的DEPC水。即可得到高质量的RNA样品。
小量提取RNA
- 将取的材料置于放有小钢珠的ep管中,迅速将样品置于液氮中。取材完毕后用球磨仪进行磨样。
Note:球磨仪放置EP管的配件需要液氮预冷,用球磨仪的最高速度打磨样品30s,将样品取出放回液氮保证样品冷却,再次冷冻球磨仪放置EP管的配件,二次打磨样品以保证样品研磨的充分。
- 快速向2ml ep管中加入1ml trizol,剧烈涡旋震荡30s-1min,将离心管置于roller wheel 上室温涡旋1hr-1.5hr。使trizol和样品充分反应。
- 加入200μL 的氯仿,剧烈涡旋震荡。室温静置到自然分层。
- 12000rpm 4℃离心15min后吸取上清,转移到新的灭过菌的离心管中。再次加入等体积的氯仿,剧烈涡旋震荡,室温静置到自然分层。
- 12000rpm 4℃离心15min后吸取上清,转移到新的灭过菌的离心管中。加入等体积的异丙醇,剧烈涡旋震荡,室温静置30min-1hr。
- 12000rpm 4℃离心20min,可以看到管底有白色沉淀。轻轻倒出离心管中液体。保证沉淀不随倾倒流出。
- 加入75%乙醇1ml,轻轻震荡,使沉淀悬浮,静置2-3min。
- 12000rpm 4℃离心30min,轻轻倒出离心管中液体,此步需要格外小心,不要使沉淀流出。
- 再次将高速离心管离心 4℃ 12000rpm 3-5min, 用灭过菌的枪头吸取管底残留乙醇。将离心管倒置于无菌的滤纸上5min左右,加入65℃的DEPC水50-100μL,回溶RNA。
- 保存于-80℃超低温冰箱中。
MOPS胶的配置
10X MOPS 缓冲液(200ml):
8.37g MOPS
0.82g 醋酸钠
0.744g EDTANa2
溶于经DEPC处理的水中,调节PH至7.0,高温灭菌避光保存。
配胶:(1.2%琼脂糖胶)
500ml三角瓶中加入1.8g 琼脂糖,
加入110ml DEPC水,微波炉加热至溶解,溶解后置于65℃水浴锅中。待溶解的胶温度降下来后,在通风橱中,向溶解好的琼脂糖胶中缓慢加入15ml 10XMOPS 缓冲液以及25ml 37%的甲醛,并摇动三角瓶。摇匀后倒入胶槽中。
胶凝好后,将胶放入含有1XMOPS 缓冲液的电泳槽中,预电泳15min作用,用200μl枪冲洗点样孔。
Note:胶内不加入核酸染料
RNA样品的制备
Nano drop 测量RNA样品的浓度,计算体积,吸取等量的RNA样品,并用DEPC水调至相同体积,加入商业化的2X RNA loading (Takara)。65℃温浴 10min左右,置于冰上放置5min。
将RNA 样品点入冲洗过点样孔的MOPS胶中,根据胶的长度,以每厘米10V的电压进行电泳,一般来讲电泳越慢,电泳的条带越平整。
紫外照胶观察。
示例图片: